A fehérjék sok atomból álló komplex molekulák, ezért modellezésük nagyon bonyolult számítási módszereket illetve nagy gépi kapacitást igényel. Minden molekula rendelkezik elektron, rezgési, forgási energia szintekkel ezek gyakran egymásbalognak, es átfednek. Ezért pontos mérésük a legtöbb esetben reménytelen, mivel csak egy burkológörbét fogunk kapni. A legutóbbi két évtizedben azonban a lézerek es a merô mûszerek fejlôdésével olyan szerkezetvizsgalati módszerek alakultak ki amik nagyon pontos képet adnak ezen molekulák szerkezetérôl illetve spektrumukról. Ezen módszereket mutatnam be néhány szóban, oldalban. A két legfontosabb ilyen módszer az FLN ( Fluorscence Line Narrowing ) és a Lyuk Égetés ( Hole Burning ). Mindkét mérési módszer alacsony hômérsékletet igényel, és elég nagy felbontású detektálási eljárásokat.

Amikor megtekintünk egy szobahômérsékleten keszült spektrumot nem nagyon gondolkozunk el rajta miért olyan amilyen, pedig érdekes dolgokat láthatunk majd rajta. Azt hogy miért vannak ott látható csúcsok ahol, azt elfogadjuk kvantummechanikai számitasi eredménynek, és mérési adatnak . Ha jól belegondolunk, hogy valójában milyen sok csúcsot kéne látnunk, és hol vannak ezek már jó úton haladunk. A legtöbb csúcs nem látszik szobahômérsékleten, vagy kiszélesedések miatt sokan alkotnak egy csúcsot. A másik lényeges kérdés, miért nem függ a spektrum a megvilágítási hullámhossztól? Most ezekre a kérdésekre próbálok röviden választ adni. Ha megvizsgáljuk egy szilárd anyag spektrumát azt tapasztaljuk, hogy folytonos, vagy legalábbis sávos . A mi vizsgálataink arról fognak szólni hogy veszünk egy jellegzetes vonalas színképpel rendelkezô anyagot, ezt nevezzük kromofornak ami mondjuk Mg Mezoporfirin, aminek jól meghatározott csúcsai vannak . Ha ezt berakjuk egy fehérjébe, mondjuk HRP-ba (Torma-Peroxidáz), ezek a szép csúcsok elkenôdnek és nem egy éles csúcsuk lesz, hanem az éles ( Zero Fonon Vonal ) és még egy fonon sáv ( Fonon Wing ). Ezt az effektust hívják matrix hatásnak, ahogy a kromofór és a környezetében levô fehérje csatolódik. Ez a második sáv, erôsen hômérséklet függô, és ez továbbitja a gerjesztést a többi sáv irányába. Vagyis magas hômérsékleten ezek erôsen átfednek egymásba, és bárhol gerjesztjük a mintát a fonon sávok miatt minden sáv gerjesztôdik. Ezek után érthetô miért mindegy szobahômérsékleten, milyen hullámhosszúságban végzünk gerjesztést. Ha alacsony hômérsékleten dolgozunk ez nincs így, ha változtatjuk a gerjesztés helyét változik a spektrumvonalak nagysága. Ennek a kiértékelésébôl lehet mondani valamit a kromofór környezetére.

A másik technika lényege az hogy egy jól meghatározott helyen a spektrumnak égetünk egy lyukat. Ez annyit jelent, hogy azon a bizonyos helyen adszorbeálló molekulákat átrakjuk egy másik konformációba, erôs lézeres gerjesztéssel, ami valójában ezek után máshol fog elnyelni. A lézeres gerjesztés befejezése után, a lyuk méret változás mérésébôl meg tudjuk határozni milyen változások történtek a molekulákban. Általában a lyuk mérete növekszik majd eltûnik. Ezen folyamatokból lehet következtetni a fehérje konformációs térképére.

A fent részletezett két módszer nagyon finom eljárási módszereket igényel. Alacsony hômérséklet, pontos lézer hullámhossz beállítás rezgésmentes merôállvány stb. A legtöbb ezek közül bonyolult elektronikai es optikai elemeket tartalmaz. Most megpróbálom vázolni mi is történik valójában a mérôasztalon.

A mintát amit vizsgálunk elöször egy átlátszó küvettába rakjuk, amit egy forró He-mal telt tartályba kell rakni, azután ezt a tartályt folyékony nitrogénbe rakjuk. Természetesen nem árt az egészet egy olyan edénybe rakni ami jó hôszigetelô, és a hôsugárzást is ha lehet, belül, a két edény között fényvisszaverô foliával biztosítsuk. A kriosztáton szükséges még ablakokat hagyni hogy a fényt valahol be tudjuk vezetni, és a mérni kívánt fényt ki tudjuk vezetni. A mérésre használt fényforrás két féle lehet vagy festéklézert használunk, vagy lámpa fényét bontjuk fel. Az elsô pontosabb eredményt ad, a második viszont nagyobb scannelési intervallumot. A fény detektálás erre keszült fotonsokszorozoval kell megoldani. A lézer hullámhosszának mérése is fontos, erre különbözô módszerek alkalmazhatók, de a legpontosabb eredményt interferrométerek segítségével kapjuk. Akkor nezzük a mérést a legelejerôl:

• A mintara esô fény ezen szoródik, majd a fotonsokszorozóba jut. Természetesen két fotonsokszorozora van szükség, hogy az alapvonalat is tudjuk mérni. A két mért adat hányadosa a keresett érték.
• A minta természetesen legyen a fénysugár útjában, mert ha a fény elmegy mellette a fotonsokszorozot az nagyon megzavarhatja, mivel ezt is belemerjük a jelbe.
• A fotonsokszorozó feszültséget úgy válasszuk meg hogy a két jel hányadosa lehetôleg egy legyen, és a zaj miatt nem árt ha ez a nulla és a maximum között felúton található.
• A mintára esô scannelô fény erôssége legyen akkora, hogy ne okozzon konformáció változást a minta fehérjéibe. ( természetesen mindig okoz, de ez minnél kisebb legyen )
• A mintát körülvevô dolgok lehetôleg ne verjék vissza a fényt, mert a szóródó fény is zavarja a mérést. Legjobb, ha fekete színû a minta környzete.